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凍干機(jī)如何在血液中制備抗菌肽

08/06

    凍干機(jī)如何在血液中制備抗菌肽?抗菌肽原指昆蟲體內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的堿性多肽物質(zhì),由20~60個(gè)氨基酸殘基組成。這類活性多肽多數(shù)具有強(qiáng)堿性、熱穩(wěn)定性以及廣譜抗菌等特點(diǎn)。在養(yǎng)殖業(yè)里,主要用于替代抗生素作保??;可用于治療免疫缺陷疾病,主要作用抗菌、免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)損傷。

    國內(nèi)外關(guān)于雞源抗菌肽的研究,主要針對(duì)雞小腸中的抗菌肽,而血中抗菌肽的提取及抗菌活性研究在國內(nèi)外卻很少有報(bào)道。目前,我國雞的飼養(yǎng)量很大,屠宰雞的下腳料雞血很多,對(duì)其進(jìn)行抗菌肽的提取和研究,是對(duì)資源的利用和再開發(fā),是很有必要的。

   雞血中抗菌肽的提取方法,其特征在于:它包括如下具體步驟:

     一、雞血采集:從屠宰場采取新鮮雞血2-3L,使用5%檸檬酸鈉抗凝; 

    二、萃取:將新鮮雞血放置37℃溫箱靜置l_2h,取上清按照1:4的比例加入0.84%氯化銨溶液,混勻靜置3min,常溫400r/min離心10min,棄上清按比例加入氯化銨溶液混勻靜置3min,再次500r/min離心10min ;棄上清,使沉淀與少量4℃的生理鹽水短時(shí)間混合,再用200ml的4℃的10%冰醋酸使沉淀懸浮,充分混勻,倒入50ml燒杯,超聲波處理50次,然后溶液使用磁力攪拌器混勻攪動(dòng)于4℃下萃取一夜;次日,將萃取的溶液取出15000r/min離心30min,取上清4℃下保存,沉淀再次混懸于冷的10%醋酸中,充分混勻,混勻攪動(dòng)于4℃下萃取一夜;第三天將萃取的溶液取出15000r/min離心30min,最后將溶液4℃下保存; 

    三、除酸、濃縮:合并所保存的溶液,將溶液注入透析袋,扎緊袋口,然后將其放入燒杯,再向燒杯中倒入蒸餾水,蒸餾水液面要超過透析袋,4℃下透析除酸,每12h換水一次,直至透析袋外蒸餾水pH大于6,將透析袋放入瓷盤中,撒上聚乙二醇6000,透析濃縮約3-4h后即可將透析袋取出,將濃縮的溶液取出低溫凍干,轉(zhuǎn)移至青霉素小瓶中,密封-20℃保存; 

    四、抗菌肽的分離:將凍干樣品用0.5%甲醇溶解,再上樣于層析柱葡聚糖凝膠SephadexG25,同時(shí)打開柱的下端出口,注意控制流速為lmL/min,5mL/管,用部分收集器收集洗脫液,5mL/管,收集的溶液用紫外分光光度計(jì)測其在280nm處的吸收值,將在280nm處有吸收的溶液分裝于青霉素瓶中,再在低溫凍干機(jī)中凍干,-80℃保存,取各瓶凍干保存的樣品各20mg,分別溶于滅菌雙蒸水中,無菌條件下用微孔濾膜過濾樣品,將藥敏紙片浸泡于過濾后的樣品中,浸泡過夜后,用平皿紙片法初篩,收集具有抗菌活性的組分,置于5℃保存; 

   五、抗菌肽的純化與濃縮:使用超濾裝置進(jìn)行超濾,膜包選用截流分子量為20kD,洗脫液選用0.5%甲醇溶液,濾出液 既 為所要獲得的溶液。


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